Спектрофотометрично колориметрично определяне на белтъка
Протеините обикновено са смес от протеини. Колориметричните анализи се основават на протеинови съставки: Аминокиселини (напр. Тирозин, серин) взаимодействат с допълнителна хромогенна група или багрило, за да се получи цветно вещество. Концентрацията на оцветения материал е пряко свързана с броя на аминокиселините, които протеинът реагира, като по този начин отразява протеиновата концентрация.
Колориметричен метод
Има няколко метода като BCA, Bradford и Lowry.
Методът Lowry: Въз основа на най-ранната Biuret реакция и подобрена. Протеинът реагира с Cu2, за да се получи синя реакция. Методът Lowry обаче е по-чувствителен от Biuret. Недостатъкът е необходимостта от последователно добавяне на няколко различни реагента; реакцията отнема много време; е податлива на небелтъчни вещества; протеини, съдържащи EDTA, Triton х-100 и амониев сулфат, не са подходящи за този метод.
Изследване на бицинонининова киселина: Това е по-нов, по-чувствителен протеинов анализ. Протеинът, който се анализира, реагира с Cu2 в алкален разтвор, за да се получи Cu, което образува хелат с BCA, за да се образува пурпурно съединение с пик на абсорбция при 562 nm. Линейната връзка между концентрацията на това съединение и протеина е силна и образуваното след реакцията съединение е много стабилно. По отношение на метода Lowry, операцията е проста и чувствителността е висока. Въпреки това, подобно на метода на Lowry, той е податлив на смущения с протеини и детергенти.
Методът на Брадфорд: Принципът на този метод е, че протеинът реагира с Coomassie Brilliant Blue, за да произведе оцветено съединение, което абсорбира при 595 nm. Най-голямата му черта е чувствителността, която е 2 пъти по-голяма от тази на Lowry и BCA. Тя е по-проста и по-бърза. Тя изисква само един вид реакционен реагент. Съединението може да бъде стабилно за 1 час, за да се улесни резултатът; Взаимодействайки с Lowry, BCA реагира с редуциращи агенти (напр. DTT, меркаптоетанол). Въпреки това, той все още е чувствителен към детергентите. Основният недостатък е, че различните стандарти могат да доведат до големи различия в резултатите от една и съща проба и няма сравними резултати.
Някои изследователи, които за първи път са изложени на колориметрични измервания, могат да бъдат объркани от резултатите от различните колориметрични тестове. Какви методи смятате за объркани? Поради факта, че групите реагират по различни начини и хромогенните групи не са еднакви, няколко метода се използват едновременно, за да се направят концентрациите на пробата от една и съща проба непоследователни. Например, Keller et al. тестваха протеина в човешкото мляко и установиха, че концентрациите, измерени от Lowry и BCA, са значително по-високи от тези на Bradford. Разликата е значителна. Дори ако се определи една и съща проба, стандартната проба, избрана чрез същия колориметричен метод, е несъвместима и концентрацията след теста също е несъвместима. Например, използвайте Lowry, за да тествате протеина в клетъчния хомогенат, като използвате стандарта BSA с концентрация 1,34 mg / ml и стандартен глобулин с концентрация 2,64 mg / ml. Следователно, преди да се избере колориметричен метод, за предпочитане е да се отнесе към химичния състав на пробата, която ще се тества, и да се намери химически подобен стандартен протеин като стандарт. В допълнение, колориметричният метод за количествено определяне на протеини често предизвиква проблеми, тъй като стойността на абсорбцията на пробата е твърде ниска, което води до голяма разлика между измерената концентрация на пробата и действителната концентрация. Основният въпрос е, че цветът на важната част от спектрофотометъра 1011, кюветата, има определен полуживот, така че всеки колориметричен метод изброява реакционното време за изпитване. Всички проби (включително стандартни проби) трябва да бъдат тествани в рамките на това време. Ако времето е твърде дълго, получената стойност на абсорбцията става по-малка и преобразуваната стойност на концентрацията намалява. Освен това реакционната температура, стойността на рН на разтвора и т.н. са важни фактори, които влияят върху експеримента. Освен това е много важно да се използва пластична колориметрия. Избягвайте да използвате кювети от кварц или стъкло, защото цветът след реакцията ще доведе до оцветяване на кварц или стъкло, което ще доведе до неточна абсорбция на пробата.
Фирмата е специализирана в продажбата на спектрофотометри , добре дошли клиенти, които имат нужда да се консултират и купуват, ние ще ви предоставим искрени услуги и качествени продукти, както и по-ниски цени.
Електронна поща: info@sumerlab.com
Уеб: sumerinstrument.com