Спектрофотометрите са станали рутинни инструменти в съвременните лаборатории за молекулярна биология. Често се използва за нуклеинова киселина, количествено определяне на протеини и количествено определяне на бактериалните растежни концентрации.
Прост принцип на спектрофотометър
Спектрофотометърът използва светлинен източник, който може да генерира множество дължини на вълните и преминава през серия от спектроскопски устройства, за да генерира светлинен източник със специфична дължина на вълната. След като светлинният източник преминава през изпитваната проба, част от светлинния източник се абсорбира и се изчислява абсорбцията на пробата, като по този начин се превръща в концентрация на пробата. , Абсорбцията на пробата е пропорционална на концентрацията на пробата.
Количествено определяне на нуклеинови киселини
Количественото определяне на нуклеиновите киселини е най-често използваната функция на спектрофотометъра. Олигонуклеотиди, едноверижни, двойноверижни ДНК и РНК могат да бъдат количествено определени в буфер. Пикът на абсорбция на най-високия пик на абсорбция на нуклеинова киселина е 260 nm. Молекулярният състав на всяка нуклеинова киселина е различен, така че коефициентите на превръщане са различни. За да определите количествено различни типове нуклеинови киселини, предварително изберете съответните коефициенти. Например, абсорбцията на 1 OD съответства на 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNA и 30 μg / ml Olig. Абсорбцията след теста се преобразува чрез горните коефициенти, за да се получи съответната концентрация на пробата. Преди изпитване, изберете правилната процедура, въведете обема на основния разтвор и разредителя и след това тествайте празната проба и разтвора на пробата. Опитът обаче не винаги е бил гладък. Нестабилните показания могат да бъдат най-голямото главоболие за експериментатора. Уредите с по-висока чувствителност показват по-голямо отклонение в абсорбцията.
В действителност принципът на проектиране и принципът на работа на спектрофотометъра позволяват абсорбцията да варира в определен диапазон, т.е. инструментът има определена точност и прецизност. Например, точността на Eppendorf Biophotometer е <1,0%> Резултатите от такива многократни тестове варират между около 1.0% от средната стойност и са нормални. Освен това е необходимо също да се вземат под внимание физикохимичните свойства на самата нуклеинова киселина и рН на буфера, в който се разтваря нуклеиновата киселина, концентрацията на йони и т.н .: Когато концентрацията на йони е твърде висока по време на теста, четенето се променя, затова се препоръчва да се използва определена стойност на рН и ниска концентрация на йони. Буферите, като TE, значително стабилизират показанията. Концентрацията на разреждане в пробата също е фактор, който не може да бъде пренебрегнат: поради неизбежното присъствие на някои фини частици, особено проби от нуклеинови киселини, в пробата. Наличието на тези малки частици пречи на резултатите от теста. За да се сведе до минимум влиянието на частиците върху резултатите от теста, абсорбцията на нуклеиновата киселина трябва да бъде поне по-голяма от 0.1 А, и абсорбцията за предпочитане е между 0.1 и 1.5 А. В този диапазон, интерференцията на частиците са относително малки и резултатът е стабилен.
Това означава, че концентрацията на пробата не трябва да бъде твърде ниска или прекалено висока (извън обхвата на изпитване на фотометъра). Накрая, работните фактори, като смесването, трябва да са достатъчни, в противен случай абсорбцията е твърде ниска, дори отрицателни; сместа не може да има мехурчета, празната течност няма суспендирана материя, в противен случай четенето се отклонява драстично; за изпитване на празната проба и пробата трябва да се използва същата кювета. В противен случай разликата в концентрацията е твърде голяма; коефициентът на преобразуване и единицата за концентрация на пробата се подбират последователно; не може да се използва кювета с износване на прозореца; обемът на пробата трябва да достигне минималния обем, изискван от кюветата.
В допълнение към концентрацията на нуклеинова киселина, спектрофотометърът показва също няколко много важни съотношения, показващи чистотата на пробата, като например съотношението A 260 / A 280, използвано за оценка на чистотата на пробата, тъй като абсорбционният пик на протеина е 280 nm. Чиста проба с съотношение по-голямо от 1.8 (ДНК) или 2.0 (РНК). Ако съотношението е по-ниско от 1,8 или 2,0, то показва наличието на протеини или фенолни вещества. А 230 показва, че някои примеси присъстват в пробата, като въглехидрати, пептиди, феноли и т.н., и съотношението на по-чистата нуклеинова киселина А 260 / А 230 е по-голяма от 2,0. А 320 открива мътността на разтвора и други фактори на смущения. За чисти проби A 320 обикновено е 0.
Хангжу Sumer Инструмент Ко, ООД
Добави: No.168 Wuchang Ave., Yuhang област, Хангжу 310023, Китай
ТЕЛ: + 86-571-88739859
Телефон: +8618658504900
Електронна поща: info@sumerlab.com
Уеб: sumerinstrument.com