Въведение в принципа и приложението на общи компоненти на спектрофотометър

Спектрофотометърът се използва широко в биологични, химични, клинични и екологични изследвания.
Спектрофотометрията измерва колко светлина може да абсорбира химикал, преминавайки лъч светлина през проба в спектрофотометър.
Чрез измерване на откритата интензивност на светлината методът може да се използва за определяне на концентрацията на разтвореното вещество в пробата.
Концепцията за спектрофотометрия
Лъчът, изпратен към пробата, се състои от фотонен лъч.
Когато фотоните се срещнат с молекулите в пробата, молекулите могат да абсорбират част от тях, да намалят броя на фотоните в лъча и да намалят интензитета на сигнала за откриване.
Пропускливостта е част от светлината, преминаваща през пробата. Определя се като интензитет на светлината, преминаващ през пробата при интензитета на падащата светлина.
Абсорбцията е обратна на коефициента на пропускане, съответстващ на количеството, измерено от спектрофотометъра.
Според абсорбцията концентрацията на пробата от разтвора може да бъде определена от закона на Ламберт, който показва, че има линейна връзка между абсорбцията и концентрацията на пробата. Според закона на Ламберт за бирата абсорбцията е продукт на коефициента на поглъщане, който е мярка за количеството светлина, погълната от разтвореното вещество при дадена дължина на вълната и разстоянието, през което преминава светлината. Проба или разстояние за пътуване и концентрация на разтворители. Като цяло целта на измерването на абсорбцията е да се измери концентрацията на пробата.
Компоненти на спектрофотометър
Всеки спектрофотометър се състои от източник на светлина, колиматор (леща или фокусиращо устройство за предаване на силни и прави лъчи), монохроматор за разделяне на лъчи с различна дължина на вълната и селектор за дължина за избор на вълната или жлеба с желаната дължина на вълната. Дължината на вълната на светлината, използвана в спектрофотометъра, представен в това видео, е в обхвата на ултравиолетовата и видимата светлина. Спектрофотометърът включва също държач за проба, фотодетектор и екран, показващ резултатите от детектора.
Най-новият спектрофотометър е директно свързан с компютър, където могат да се контролират експериментални параметри и да се покажат резултатите.
Принцип на работа на спектрофотометъра
Когато извършвате спектрофотометрия, е важно да вземете подходящи предпазни мерки, като например носенето на ръкавици, в зависимост от вида на биологичния или химическия разтвор, който използвате.
Включете устройството и оставете лампата и електрониката да се нагряват преди измерване на UV-Vis спектъра на пробата.
Пригответе празна проба от същия разтвор със същото pH и подобна йонна сила, но без анализираните компоненти; тъй като кюветата и разтворителят могат да разпръснат светлина, е необходимо да се анализира пробата.
Традиционният държач за проби от спектрофотометър е проектиран да побира пластмасови и кварцови купи. Пипетирайте оригиналния разтвор в купа.
След като изтриете всички пръстови отпечатъци и ги напръскате от външната страна на купата, поставете правилно кюветата в държача за проба и затворете вратата на капака.
Никога не забравяйте да затворите вратата, защото UV лъчението от отворен спектрофотометър може да увреди очите и кожата ви.
Програмирайте желаната дължина на вълната или дължината на вълната, която ще бъде предадена на пробата. Това зависи от най-добрата дължина на вълната, която анализираният компонент може да абсорбира. След това машината се нулира чрез измерване на празната проба, която изважда дънната абсорбция поради буфера на пробата.
В зависимост от типа на спектрофотометричния експеримент, който правите, може да се наложи да се генерира стандартна крива преди измерването на пробата, от която може да се определи концентрацията на съединението, анализирано в пробата.
Оставете пробата да достигне правилната температура и внимателно разбъркайте, за да избегнете въвеждане на мехурчета. След това пробата може да бъде добавена директно в купата вътре в машината и може да се направи отчитане.
След като пробата е измерена за абсорбция, експериментът се изчислява правилно; например за определяне на концентрацията или нивото на ензимната активност.
Приложение на спектрофотометър
Едно от често срещаните приложения на спектрофотометъра е измерване на клетъчната плътност. Измерването на клетъчната плътност може да се използва за създаване на логаритмичната крива на растеж на бактериите, от която може да се определи оптималното време за интегриране на рекомбинантния протеин.
Спектрофотометърът може да се използва и за измерване на скоростта на химичната реакция. В това изпълнение абсорбцията се използва за наблюдение на ензимната реакция, която с времето изчезва чрез междинна реакция от 452 nm. Скоростта на този ензимен етап може да бъде изчислена чрез съпоставяне на данните със съответното уравнение.
Въвеждането на микроспектрофотометър елиминира нуждата от притежател на пробата. Тези спектрофотометри използват повърхностно напрежение за поддържане на пробата.
Микроспектрофотометърът е най-добрият избор за измерване на масата и концентрацията на малки и скъпи проби, като биомолекули, включително протеини и нуклеинови киселини.
Абсорбцията на протеини при 280 nm зависи от съдържанието на ароматни странични вериги, намиращи се в триптофан, тирозин и фенилаланин, както и дисулфидната връзка между двата цистеина.
Концентрацията на протеин може да бъде определена от неговата абсорбция при 280 nm и коефициента на абсорбция, който се основава на състава на аминокиселини.
ДНК и РНК имат максималната абсорбция при 260 nm, от която могат да се определят техните концентрации. Чистотата на нуклеиновите киселини също може да бъде оценена от съотношението на показанията на абсорбция към специфичните дължини на вълната.